BIOPHYSICS

Discussione e approfondimento dei principali metodi di indagine biofisica basati sulla spettroscopia e microscopia a fluorescenza (microscopia confocale, tecniche FLIM, FRET e FCS, microscopia a superrisoluzione) e loro applicazione allo studio di macromolecole biologiche e della cellula come sistema fisico complesso.

Con riferimento ai Descrittori di Dublino:

Comprensione critica degli sviluppi più avanzati della Fisica Moderna sia negli aspetti teorici che di laboratorio e delle loro interconnessioni, anche in ambiti interdisciplinari. Conoscenza e comprensione di avanzati metodi di indagine biofisica basati sulla spettroscopia e microscopia a fluorescenza. (knowledge and understanding)

Capacità di identificare gli elementi essenziali di un fenomeno, in termini di ordine di grandezza e di livello di approssimazione necessario, ed essere in grado di effettuare le approssimazioni richieste. Capacità di utilizzare lo strumento della analogia per applicare soluzioni conosciute a nuovi problemi (problem solving) e diversi contesti biofisici. Capacità di applicare metodologie fisiche a problemi di carattere biologico. (applying knowledge and understanding)

Capacità di argomentare personali interpretazioni di fenomeni fisici, confrontandosi nell’ambito di gruppi di lavoro. Sviluppo del senso di responsabilità attraverso la scelta dei corsi opzionali e dell'argomento della tesi di laurea. (making judgements)

Capacità di comunicare in lingua italiana e in lingua inglese nei settori avanzati della Fisica. Capacità di presentare una propria attività di ricerca o di rassegna a un pubblico di specialisti e non. (communication skills).

Capacità di acquisire adeguati strumenti conoscitivi per l'aggiornamento continuo delle conoscenze. Capacità di accedere alla letteratura specializzata sia nel campo della Biofisica che in campi scientificamente vicini. Capacità di utilizzare banche dati e risorse bibliografiche e scientifiche per estrarne informazioni e spunti atti a meglio inquadrare e sviluppare il proprio lavoro di studio e di ricerca. (learning skills).

L’insegnamento verrà svolto mediante lezioni frontali.

150 ore d'impegno totale di cui 108 di studio individuale e 42 di lezione frontale

 

Conoscenze di Fisica (ottica e struttura della materia) acquisite nel corso della laurea triennale.

Obbligatoria

Introduzione: cos'è la biofisica? Motivazione. La varietà degli argomenti di ricerca in biofisica. Biofisica cellulare e microscopia. Altri temi di interesse: Cryo-Electron Microscopy, Intrinsically disordered proteins, Optogenetics, Single-Molecule Biophysics, processi di entrata dei virus.

Biofisica della cellula. I mattoni della vita. Creazione di modelli in biologia, modelli quantitativi e il potere dell'idealizzazione. Cellule e strutture al loro interno: strutture macromolecolari. Scale temporali nei processi biologici: il dogma centrale della biologia, il ciclo cellulare. Equilibrio meccanico e chimico nella cellula: energia nella cellula, energia libera e struttura. Meccanica statistica ed espressione genica. Random walks e struttura delle macromolecole: dimensioni dei genomi, DNA packing, cromatina. Membrane biologiche: la natura delle membrane, vescicole. Diffusione nella cellula, effetti di crowding.

Spettroscopia a fluorescenza. Sonde fluorescenti. Assorbimento di luce UV-Visible. Spettri di eccitazione ed emissione. Extinction coefficient (EC) and quantum yield (QY). Lifetime della fluorescenza. Polarizzazione (anisotropia) dell'emissione. Quenching/Photobleaching. Spettroscopia a fluorescenza risolta nel tempo. Analisi nel dominio del tempo e delle frequenze. Strumentazione per misura della lifetime.

Microscopia ottica. Acquisizione di immagini in microscopia ottica. Contrasto. Limite di risoluzione ottica. Point Spread Function (PSF) di un microscopio. Sezionamento ottico. Microscopia confocale e multifotone. Imaging multidimensionale: imaging 3D, multi-color, time-lapse. Image processing and analisi quantitative di immagini.

Metodi avanzati di microscopia a fluorescenza. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). Analisi della FLIM basata su Phasors. Forster Resonance Energy Transfer (FRET). Microscopia FRET e applicazioni. Sensori molecolari basati sulla fluorescenza. Metodi per misurare la mobilità delle molecole: Single-Particle Tracking (SPT), Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP), Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). Principi e applicazioni delle tecniche FCS. Image correlation and cross-correlation spectroscopy (ICS and ICCS) e tecniche analoghe.

Microscopia ottica a super-risoluzione. Il superamento del limite di diffrazione (Premio Nobel per la Chimica 2014). Microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). Microscopia STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) e PALM (Photoactivatable Localization Microscopy). Microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e tecniche correlate. Separation of photons by lifetime tuning (SPLIT) e tecniche correlate. Applicazione all’imaging di cellule e macromolecole.

 

Phillips et al. Physical Biology of the Cell, CRC Press 2013

D. Jameson, Introduction to Fluorescence, CRC Press 2014

Valeur, Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Wiley-VCH Verlag GmbH 2001

Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Springer 1995

Materiale didattico fornito dal docente

Prova orale sugli argomenti del corso. Gli studenti potranno iniziare l’esame con l’esposizione di un argomento a loro scelta. L’argomento a scelta potrà essere esposto mediante una presentazione ppt, al fine di valutare anche le capacità di esposizione e comunicazione.

Tutti gli argomenti trattati durante il corso saranno oggetto d'esame.

La verifica dell’apprendimento potrà essere effettuata anche per via telematica, qualora le condizioni lo dovessero richiedere.

Origine fisica degli spettri della fluorescenza
Optical sectioning in microscopia
Rivelazione e analisi di immagini FLIM
Analisi di fluttuazioni in FCS e ICS
Descrizione di un metodo di super-resolution microscopy
Descrizione di una applicazione di biological imaging